免疫分型

免疫分型在流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用中常見(jiàn)，它利用流式細(xì)胞術(shù)的能力同時(shí)分析混合細(xì)胞群的多個(gè)參數(shù)。免疫分型基本的形式就是使熒光偶聯(lián)抗體與細(xì)胞表面對(duì)應(yīng)的抗原特異性結(jié)合，之后利用流式細(xì)胞儀，根據(jù)細(xì)胞表面的熒光對(duì)細(xì)胞做出分析。大多數(shù)抗原都有特定的分化亞群編號(hào)或者CD編號(hào)，對(duì)應(yīng)的抗體用相同的方式命名。

大多數(shù)免疫細(xì)胞都有特定的CD標(biāo)記，這些細(xì)胞標(biāo)記稱(chēng)為譜系標(biāo)記，用于定義特定細(xì)胞群，以便在每個(gè)免疫分型實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行額外分析。例如T細(xì)胞標(biāo)記物(CD3, CD4, CD8)， B細(xì)胞標(biāo)記物(CD19, CD20)，單核細(xì)胞標(biāo)記物(CD14, CD11b)和NK細(xì)胞標(biāo)記物(CD56, CD161)。

除了定義細(xì)胞群的譜系標(biāo)記外，還使用其他標(biāo)記來(lái)描述每個(gè)細(xì)胞群的特征。這些標(biāo)記包括激活標(biāo)記(CD69、CD25、CD62L)、記憶標(biāo)記(CD45RO、CD27)、組織歸巢標(biāo)記(α4/β7)和趨化因子受體標(biāo)記(CCR7、CCR5、CXCR4、CCR6)等。通常，免疫分型還針對(duì)細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物，如FoxP3(定義Treg細(xì)胞)、細(xì)胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2定義Th1細(xì)胞)、增殖標(biāo)記物(Ki67、CFSE)和抗原特異性標(biāo)記物等。

抗原特異性反應(yīng)

在抗原特異性反應(yīng)中，使用特定抗原刺激細(xì)胞，之后通過(guò)MHC多聚體來(lái)尋找細(xì)胞因子產(chǎn)生、細(xì)胞增殖、細(xì)胞激活、細(xì)胞記憶或抗原識(shí)別等。MHC多聚體是化的MHC單體(MHC-I或MHC-II)以四聚體、五聚體或右旋聚體的形式結(jié)合在熒光鏈霉親和素骨架上。這些MHC多聚體被“裝上"特定的抗原，之后與識(shí)別該抗原的T細(xì)胞結(jié)合，用來(lái)表明T細(xì)胞對(duì)特定抗原的反應(yīng)水平?？乖禺愋苑磻?yīng)通常用于疫苗研究。

胞內(nèi)因子檢測(cè)

胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)通常使用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑(Brefeldin A或Monensin)處理細(xì)胞2-12小時(shí)，使細(xì)胞產(chǎn)生的各種細(xì)胞因子在胞內(nèi)積累，便于更好地檢測(cè)。在這個(gè)處理過(guò)程中，細(xì)胞可以被各種抗原刺激(例如疫苗中的多肽)，以檢測(cè)細(xì)胞的免疫反應(yīng)。在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑處理完畢后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行活力標(biāo)記和細(xì)胞表面標(biāo)記染色，之后進(jìn)行固定和滲透，以使細(xì)胞因子抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)染色。

細(xì)胞增殖檢測(cè)

細(xì)胞增殖可以通過(guò)幾種不同方法來(lái)測(cè)定，這些方法可靶向與細(xì)胞增殖相關(guān)的事件，例如將胸苷類(lèi)似物(BrdU)摻入復(fù)制中的DNA、可遺傳染料的世代跟蹤、增殖相關(guān)抗原(Ki67、PCNA)的表達(dá)檢測(cè)等。

細(xì)胞凋亡檢測(cè)

流式細(xì)胞術(shù)利用與凋亡相關(guān)的級(jí)聯(lián)事件的靶點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)：膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)靶向易位的細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)行染色；TUNEL(TdT dUTP Nick End Labeling)靶向內(nèi)切酶消化的DNA進(jìn)行標(biāo)記；抗體和染料靶向半胱天冬酶（Caspases）的激活；確定線粒體膜電位的染料靶向線粒體凋亡；Hoescht 33342靶向細(xì)胞核中的染色質(zhì)凝聚。

Annexin V是一種磷脂結(jié)合蛋白，能夠與細(xì)胞凋亡過(guò)程中被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜外表面的磷脂酰結(jié)合。Annexin V應(yīng)與排除活性染料(如碘化丙啶)聯(lián)合使用，以確保Annexin V與磷脂的結(jié)合發(fā)生在細(xì)胞膜外表面。

TUNEL是一種利用末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶(TdT)的能力，用dUTP(脫氧尿苷三磷酸)或BrdU標(biāo)記與凋亡相關(guān)的DNA斷裂末端的技術(shù)。dUTP或BrdU用熒光色素標(biāo)記用于檢測(cè)，在數(shù)據(jù)采集之前用DNA染料對(duì)細(xì)胞進(jìn)行反染色

Caspase信號(hào)通路會(huì)在大多數(shù)細(xì)胞凋亡過(guò)程中被激活，其產(chǎn)生的活化Caspase 3能夠被相應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)染色劑和抗體特異性結(jié)合。

檢測(cè)線粒體凋亡的方法是使用染料JC-1來(lái)檢測(cè)線粒體膜電位。此外，有一種抗體可針對(duì)APO2.7——一種僅在細(xì)胞凋亡過(guò)程中表達(dá)且定位于線粒體膜上的蛋白。